摘要：目的建立流式細胞儀測定血小板胞漿游離鈣離子濃度\[Ca2+\]i的方法。方法 用Fluo3AM作為鈣指示劑，在有或無細胞外鈣\[Ca2+\]o存在的條件下，測定靜息和凝血酶激活狀態下人血小板胞漿游離鈣離子濃度\[Ca2+\]i的變化。結果Fluo3AM標記的血小板的平均熒光強度明顯增加。凝血酶使負載Fluo3AM標記的血小板胞漿\[Ca2+\]i明顯增加，且顯示劑量依賴和對\[Ca2+\]o的依賴。結論凝血酶引起血小板胞漿\[Ca2+\]i增加的來源主要是\[Ca2+\]o，可能也有部分是內鈣釋放的參與。

關鍵詞：流式細胞儀；血小板；鈣；凝血酶
                     
Determinationofthelevelofcytoplasmicfreecalcium
inhumanplaetswithflowcytometry

ZhuangMingming,WenYixin,LiuShaolie,HongXiaopeng

（DepartmentofClinicalLaboratoryofOverseasChineseHospital,Puning515300,China）

ABSTRACT:ObjectiveTosetupamethodtodeterminecytoplasmicfreecalcium\[Ca2+\]iinhumanplaetswithflowcytometry.MethodsAsacalciumindicator,Fluo3AMwasusedtodeterminethechanges,inducedbythrombin,ofthelevelofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]iinpresenceorabsenceofoutsidecalcium\[Ca2+\]o,inordertoelucidatewheretheplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]imainlycomefromanditsroleintheactivityofplaets.ResultsThegeometricmeanoffluorescenceintensityoftheplaet,labeledwithFluo3AM,wasincreasedobviously.Theconcentrationofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]iwasincreasedsignificantlybythrombininadoseand\[Ca2+\]odependentmanner.ConclusionTheincreasedlevelofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]o,inducedbythrombin,mainlycomesfrom\[Ca2+\]oandpartlyfromthereleased\[Ca2+\]oofintraplaetprobably.

KEYWORDS:flowcytometry;plaet;calcium;thrombin

血小板胞漿游離鈣離子\[Ca2+\]i與血小板的許多形態與功能活動有關，如血小板形態的改變、聚集、收縮、釋放、分泌等。也與血小板參與的凝血、血液流變性調節（如血液黏度、流動性等）以及動脈粥樣硬化、腦血管疾病的發生和發展、血管內皮活動等生理、病理過程有關。研究發現\[1\]，當血小板內的\[Ca2+\]i達到一定的閾值（400nmol/L）就會發生釋放反應以及可逆性聚集。達到另一個閾值（800nmol/L），就會發生不可逆性聚集。因此，研究血小板胞漿游離鈣濃度的變化，對闡明血小板參與和調節的許多生理生化以及病理過程有重要意義。人們常用鈣熒光指示劑（水母素、Quin2、fura2、Fluro2AM、Fluo3Am）和雙波長熒光光度術測定細胞胞漿游離鈣濃度\[2-4\]。本文在建立流式細胞術法測定血小板胞漿游離鈣濃度的基礎上，研究了凝血酶誘導的人血小板胞漿游離鈣濃度的變化。

1.1實驗材料

1.1.1血液樣本       

成人血樣，男女兼有，1個月內沒有服用阿司匹林及其他影響血小板功能的藥物。空腹肘靜脈采血，用ACD（ACD∶血=1∶6）抗凝。

1.1.2藥品與試劑       

Fluo3AM（溶于DMSO中）、EGTA（溶于超純度去離子水中）、TritonX100、ADP、凝血酶、小牛血清白蛋白（BSA），均為Sigma（USA）公司產品。ACD（mmol/L：枸櫞酸7,枸櫞酸三鈉85，葡萄糖100）。Hepes緩沖液（mmol/L:NaCl145,KCl5,MgSO41.0,Hepes10,Na2HPO40.5,葡萄糖10,pH7.4）。CaASAHepes緩沖液（在Hepes緩沖液中加入120mmol/LCaCl2和0.94mmol/LASA，pH7.4）。CaHepes緩沖液（在Hepes緩沖液中加入120mmol/LCaCl2，pH7.4）。其他試劑均為市售產品。

1.1.3主要儀器       

FACSCalibur型流式細胞儀，美國BectonDickinson公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1富血小板血漿（PRP）制備       

抗凝血200×g離心10min，取上清即得富血小板血漿（PRP）。

1.2.2負載Fluo3AM血小板懸液制備       

取PRP，加入乙酰水楊酸（ASA），使終濃度為0.94mmol/L。輕輕搖勻后800×g離心10min，棄上清。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes緩沖液1mL，800×g離心10min，棄上清。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes緩沖液重懸血小板，調節血小板濃度為2×109/mL。在血小板懸液中加入BSA（終濃度為1.5g/L）和Fluo3AM（4.0μmol/L），輕搖混勻后，在37℃水浴孵育30min后，800×g離心10min，棄上清，用1mLCaHepes緩沖液重復2次，洗去溶液中多余的Fluo3AM。用Hepes緩沖液重懸血小板，調節其濃度為2×106/mL。

1.2.3流式細胞儀測定血小板胞漿\[Ca2+\]i        

取負載Fluo3AM的血小板懸液0.5mL，加入3mL聚乙烯試管中，用CellQuest軟件獲取和分析數據，激發波長為488nm，測定時，用側向角（SSC）F1（Fluo3AM）散點圖識別血小板，用F1直方圖測定平均熒光強度。每個樣本獲取10000個血小板。用CrykiewiczG\[5\]的等比值法公式計算出血小板胞漿\[Ca2+\]i：\[Ca2+\]i＝Kd×（F－Fmin）/（Fmax－F）式中Kd是Ca2+結合Fluo3AM的解離常數，為204nmol/L（37℃）。F為各樣本熒光強度的測定值。Fmax和Fmin分別是zui大熒光強度和zui小熒光強度的測定值。

zui大熒光強度和zui小熒光強度的測定：在各試管中加入60g/LTritonX100、5mmol/LCaCl2，搖勻，靜置10min，用流式細胞儀測定平均熒光強度，此乃zui大熒光強度。用無鈣的Hepes緩沖液重懸血小板，調其濃度為2×106/mL，加入25mmol/LEGTA（鈣特異性絡合劑），搖勻，靜置10min，用流式細胞儀測定平均熒光強度，此乃zui小熒光強度。

1.2.4凝血酶對血小板胞漿\[Ca2+\]i的影響       

分別研究緩沖液中有鈣和無鈣存在時，凝血酶對血小板胞漿游離鈣濃度的影響。在CaASAHepes緩沖液和無鈣的Hepes緩沖液中加入凝血酶10、100、1000U/L，用此緩沖液制備負載Fluo3AM的血小板懸液，用流式細胞儀測定10000個血小板的平均熒光強度。為了觀察血小板\[Ca2+\]i隨時間的變化，分別在加入凝血酶后5、10、15min時各測定一次。
〖2〗西安交通大學學報（醫學版）〖3〗第26卷5期〖2〗莊明明，溫奕欣，劉少列，等.流式細胞儀測定血小板胞漿游離鈣濃度1.3       統計學方法       所用數據用±s表示，用SPSS10.0version軟件和tstudenttest法統計分析實驗結果。

2.1人血小板胞漿\[Ca2+\]i       

將樣本放置在樣本架上，按下"run"按鈕，開始獲取數據，以未標記熒光素的樣本為空白對照，并用它調整陰性區域的位置，然后依次測定各個樣本。結果見圖1。

2.2在外鈣\[Ca2+\]o存在時凝血酶刺激對人血小板\[Ca2+\]i的影響       

在1mmol/L\[Ca2+\]o存在時，血小板靜息\[Ca2+\]i為（108.9±10.5）nmol/L（n=8），在加入10、100、1000U/L凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i明顯上升，而且有明顯的劑量依賴關系（表1）。100U/L凝血酶可以使\[Ca2+\]i增加6.4倍。5min時，血小板\[Ca2+\]i水平較開始加入凝血酶時降低，10min時接近于靜息水平。

2.3無外鈣\[Ca2+\]o存在時人血小板\[Ca2+\]i對凝血酶刺激的反應       

在緩沖液中沒有鈣存在的情況下，血小板的\[Ca2+\]i為（29.5±5.6）nmol/L（n=8），緩沖液中凝血酶的水平為10、100、1000U/L時，血小板\[Ca2+\]i的水平有所上升，但上升的程度明顯小于有外鈣時。100U/L凝血酶使血小板\[Ca2+\]i增加1.3～1.5倍，并在5min時恢復到靜息水平（表1）。表1有或無\[Ca2+\]o時凝血酶對血小板\[Ca2+\]i的影響（略）
    
3討論

本實驗使用的Fluo3AM為細胞可通透的細胞內鈣熒光指示劑，在沒有水解前和（或）無Ca2+存在時，不顯示熒光，低親和性結合測量到的瞬間Ca2+峰值比Fura2的高\[6\]。TritonX100能增加細胞膜通透性，提高胞漿內Ca2+的濃度，因此，用它測定胞漿內Ca2+飽和濃度。EGTA\[Ethylenelycolbis（2aminoethylether）-N,N,N′,N′tetraaceticacid\]是鎂存在時測定鈣濃度的鰲合劑\[7\]，也是有效的金屬蛋白酶的抑制劑\[8\]，在測定zui小熒光強度時，用EGTA絡合胞漿內的Ca2+，使胞外的Ca2+濃度zui低。ASA（乙酰水楊酸）是血小板穩定劑，可以防止血小板聚集，并保證血小板的功能完善。

血小板靜息\[Ca2+\]i是指沒有任何刺激存在時，血小板胞漿的游離鈣濃度。實驗結果顯示，\[Ca2+\]o為1mmol/L時，人血小板的靜息\[Ca2+\]i為（108.9±10.5）nmol/L；\[Ca2+\]o為0mmol/L時，其靜息\[Ca2+\]i為（29.5±2.6）nmol/L。在血小板緩沖液中加入凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i迅速上升，而且有明顯的劑量依賴關系。\[Ca2+\]o為1mmol/L時，0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板內游離鈣濃度分別上升1.58、6.42和10.05倍。另外，\[Ca2+\]o為0mmol/L時，凝血酶也使\[Ca2+\]i有所提高，但提高的幅度明顯減少，如0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板內游離鈣濃度分別上升0.13、1.3和2.5倍。結果說明，血小板\[Ca2+\]i的高低與\[Ca2+\]o存在與否有密切關系。而且在凝血酶的刺激存在時，\[Ca2+\]i提高的程度也與\[Ca2+\]o有密切關系。提示血小板內鈣的升高主要依賴于\[Ca2+\]o的存在，但不排除內鈣釋放的參與\[9,10\]。

流式細胞術在生物醫學和分子生物學研究領域的廣泛應用，大大推進了相關學科的發展。結合熒光探針技術，對細胞表面抗原、熒光蛋白表達、DNA含量及其細胞周期、細胞凋亡等進行大量、多參數檢測與分析，是流式細胞術的特點。我們應用Fluo3AM和流式細胞術測定血小板\[Ca2+\]i，因為Fluo3AM很容易進入細胞，熒光強度高，操作方法簡單易行，測量靈敏度高，重復性好，是研究細胞內\[Ca2+\]i的有效方法。

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